forskning

Institut for Virology

forskning

Virologisk institut forskningsarbejde fokuserer på en vigtig human patogen virus, humant cytomegalovirus (HCMV). Det er en almindelig herpesvirus, der forårsager infektioner hos ca. 40% af den centraleuropæiske befolkning. I mange tilfælde er disse infektioner uden udtalt symptomer. Virussen vedvarer imidlertid i en latent form i kroppen af den inficerede: den kan genaktiveres i løbet af livet og igen forårsage sygdomssymptomer. Dette er meget ofte forbundet med nedsat immunfunktion, således at HCMV betragtes som en af de vigtigste patogener i immunsupprimerede patienter (fx transplanterede patienter). Derudover kan denne virus forårsage en infektion af det ufødte barn under graviditet, det permanente og z.T. forårsager alvorlig skade på barnet. I vores forskning karakteriserer vi molekylære detaljer om virusindtræden i målcellen (AG Sinzger →), viral genekspression (AG Stamminger →) og virusmorfogenese (AG for en →) at udvikle nye antivirale terapier og medicin. Derudover beskæftiger vi os med åbne spørgsmål om viral patogenese og analyse af virale resistensmekanismer (AG Michel →) .

Forskningsgruppe Dr. dr. Med. Thomas Stamminger

HCMV-regulatoriske proteiner og medfødt immunitet

Humant cytomegalovirus (HCMV) er fortsat en vigtig årsag til dødelighed og sygelighed hos immunkompromitterede patienter, der søger transplantatmodtagere på immunsuppressiv terapi. Endvidere er HCMV den mest almindelige årsag til intrauterin infektion, hvilket kan føre til sensorisk høretab og mental retardering. Selvom fremskridt med diagnosen HCMV-infektioner har ført til forbedrede terapeutiske strategier, lider behandling af HCMV-induceret sygdom af toksiciteten af de aktuelt tilgængelige antivirale lægemidler. Derudover er forekomsten af lægemiddelresistente virusstammer hyppigt hos patienter, hvor længere behandling er nødvendig. Derfor er udviklingen af nye antivirale lægemidler presserende nødvendigt for at forbedre behandlingen af HCMV-infektioner. Således er en af de vigtige aspekter af vores laboratorium karakteriseringen af molekylære begivenheder, der kan bruges som mål for nye antivirale strategier.

Lab-medlemmer:

Thomas Stamminger, professor dr. med. (Hovedundersøger); Myriam Scherer, dr. rer. Nat.; Eva-Maria Schilling, dr. rer. Nat.; Anna Reichel, ph.d. studerende (Erlangen); Theresa Frank, ph.d. studerende (Erlangen); Patrick King, ph.d. studerende (Erlangen); Anne-Charlotte Stilp, ph.d. studerende (Erlangen); Adriana, Svrlanska, Ph.D. studerende (Erlangen); Regina Müller, tekniker (Erlangen)

Dr. Dr. Thomas Stamminger

Telefon: +49 731-500 65100 Fax: +49 731-500 65102 E-mail: [email protected] Adresse: Albert-Einstein-Allee 11 89081 Ulm Bygning: University, M23 Room 3105

PML-nukleare organer: en cellulær struktur, der medierer iboende immunitet mod vira. Mikrobielle infektioner kontrolleres ikke kun af medfødte og adaptive immunmekanismer, men også af cellulære restriktionsfaktorer. I modsætning til den medfødte og adaptive del af immunsystemet, der kaldes patogen-inducerede signalveje i cellen, tjener som frontlinjeforsvar. Vores laboratorium undersøger, hvorvidt en subnuklear struktur, kaldet PML-nukleare organer (PML-NB’er), bidrager til cellernes modstand mod herpesvirusinfektioner. PML-NB’er er prikkelignende strukturer i cellekernen, der er defineret ved den adskilte akkumulering af specifikke cellulære proteiner som PML, hDaxx, Sp100 og ATRX (figur 1). I løbet af de sidste ti år af vores laboratorium kunne det vise, at det fungerer som en cellulær faktor ved at inducere en lyddæmpning af viral genekspression. Desuden afslørede vores forskning, at specifikke virale proteiner (pp71 og IE1 af HCMV) er i stand til at modvirke denne cellulære lyddæmpningsmekanisme (figur 1). Dette skaber en delikat balance mellem cellulært forsvar og viral antagonisme.

Fig. 1: PML-NB: en cellulær struktur, der medierer både iboende immunitet mod vira og fungerer som en koaktivering af interferonresponsen. Virale effektorproteiner, der vides at modvirke PML-NB’er, vises i den venstre del af figuren.

Molekylær mekanisme for PML-NB-forstyrrelse. I løbet af de sidste to år kunne vi afgrænse den molekylære mekanisme, da IE1 antagoniserer PML-NB’er. Som det fremgår af krystalstrukturen af IE1, interagerer dette protein direkte med PML-coiled-coil-domænet via dets kugleformede kerneområde og forstyrrer NB-foci ved at inducere en tab af PML SUMOylering. Vi var i stand til at demonstrere, at IE1 handler ved at ophæve de novo SUMOylering af PML. Afslutningsvis SUMOyleringsdynamik, IE1-ekspression med en SUMO-mutant, der er resistent over for SUMO-proteaser. Interessant nok fandt vi, at IE1-ekspression ikke påvirkede preSUMOylated PML, men det forhindrede klart de novo SUMO-konjugering. Konsistente resultater blev opnået ved in vitro SUMOyleringsassays, der viser, at IE1 alene er tilstrækkelig til denne effekt. Endvidere fungerer IE1 på en selektiv måde, da K160 blev identificeret som hovedmålet for lysin. Dette er fordi IE1 er sådan₂O₃-medieret hyper-SUMOylering af K160. Da IE1 ikke forstyrrede coiled-coil-medieret PML-dimerisering, foreslår vi, at IE1 enten påvirker PML autoSUMOylation ved direkte ophævelse af PML E3-ligasefunktion eller ved at gøre adgangen til SUMO-steder. Vores data antyder således en ny mekanisme, hvordan et viralt protein modvirker en cellulær restriktionsfaktor de novo SUMOylering ved specifikke lysinrester uden at påvirke det globale protein SUMOylering.

PML-nukleare organer som koregulatoriske strukturer for medfødt immunrespons. Beviserne for en udvidet tværgående samtale mellem iboende og medfødte immunmekanismer i forhold til PML-NB’er. For eksempel vides det, at specifikke PML-NB-faktorer, såsom PML og Sp100, induceres af interferon (IFN) og den samlede størrelse og antallet af PML-NB’er, henholdsvis, stiger ved IFN-behandling af celler. Dette indikerer, at den restriktive funktion af PML-NB’er kan forbedres via IFN’er. Nyere bevis tyder imidlertid på, at PML i sig selv fungerer som en vigtig samregulerende faktor under induktionen af interferonstimulerede gener (ISG’er) (figur 1). For eksempel observerede vi i samarbejde med PD. Dr. P. Hemmerich (Jena), at PML-proteinet er i stand til at fremme interferon-g (IFN-g) -induceret MHC-klasse II-genekspression. Aktiviteterne af PML som koaktivering af IFN er dog ikke begrænset til type II IFN’er, men udvider også til type I IFN-regulerede gener. IFN-behandling af celler, der udviser en udtømning af det endogene PML-protein. PML-NB-medieret stabilisering af transkriptionskomplekser, der kontrollerer ISG-ekspression. Som følge heraf kan PML-NB’er muligvis ikke kun modvirke det indre antivirale forsvar, men også immunrespons på IE1-proteinet fra HCMV.

Signalering af HCMV-kodede G-proteinkoblede receptorer. G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) er nøgleregulatorer for adskillige cellulære processer. Viralkodede GPCR’er demonstrerer således et effektivt middel til at omgå immunsystemet, modulere cellulære funktioner og omdirigere cellulære signalnet. Human cytomegalovirus (HCMV) koder for fire GPCR-homologer, kaldet pUS27, pUS28, pUL33 og pUL78. Idet pUS28 og pUL33 konstituerende aktiverer flere signaleringskaskader, er funktionerne af pUS27 og pUL78 endnu ikke fuldt ud forstået. For at bestemme, om pUS27 eller pUL78 viser nogen signalegenskaber, udførte vi luciferase-reporteranalyser i 293T-celler transduceret med CREB, NFAT og NF-BB-specifikke reporterkonstruktioner. Vores eksperimenter viser, at pUS27 aktiverer NF-KB afhængig genekspression. Spændende viste det sig, at NF-BB-aktivering var forskellig markant afhængigt af om N- eller C-terminalt mærkede versioner af pUS27 blev anvendt: mens transfektion af N-terminalt mærket pUS27 ikke aktiverede NF-κB, udtrykket af C-terminalt tagget versioner inducerede stærkt NF-KB signalering. Forstyrrelse af et formodet PDZ-domænebindingsmotiv ved tilsætning af en serin til C-terminalen af pUS27 induceret høj NF-KB-signalering, hvilket antyder, at pUS27 kan være negativt reguleret via et PDZ-domæneprotein. Bioinformatisk analyse afslørede eksistensen af fire formodede TRAF-bindende motiver inden for C-terminus af pUS27. Interessant nok førte mutation af et forudsagt TRAF6-bindende motiv til et fuldstændigt tab af NF-KB signalering. Den C-terminale region af pUS27 alene er essentiel og tilstrækkelig til NF-KB aktivering, vi genererede kimære proteiner med enten CD8 eller GFP. Disse kimærer aktiverede stærkt NF-KB signalering uafhængigt af deres lokalisering på henholdsvis celleoverfladen eller endosomer. Dette indikerer, at den subcellulære lokalisering af det pUS27-cytoplasmatiske domæne ikke er kritisk for NF-KB-aktivering. Desuden var vi i stand til at inducere den kanoniske NF-KB-vej gennem TRAF6 af enten ACHP, en hæmmer af IKKp-phosphorylering eller en dominerende negativ IκBa. Samlet afslører vores data en ny og meget kompleks signalefunktion for HCMV GPCR pUS27.

UL69 af humant cytomegalovirus: en viral mRNA-eksport, der styres af forskellige post-translationelle modifikationer. Den åbne læseramme UL69 for humant cytomegalovirus koder for det multifunktionelle regulatoriske protein pUL69, der fungerer som en viral mRNA-eksportfaktor via dets nukleocytoplasmatiske shuttlingaktivitet og via rekruttering af det cellulære mRNA-eksporterende maskineri ved interaktion med den cellulære DExD / H-boks RNA helikase UAP56. Vi rapporterede tidligere, at subcellulær lokalisering og mRNA-eksportaktivitet af pUL69 moduleres via phosphorylering af den virale kinase pUL97. I en nylig undersøgelse blev pUL69 underkastet yderligere posttranslationsmodifikationer såsom argininmethylering. Først demonstrerede vi en specifik immunudfældning af pUL69 i fuld længde såvel som pUL69aa1-146 af et mono / dimethylargininspecifikt antistof. For det andet observerede vi et specifikt elektroforetisk mobilitetsskifte efter overekspression af det katalytisk aktive protein argininmethyltransferase 6 (PRMT6). For det tredje blev en direkte interaktion mellem pUL69 og PRMT6 bekræftet ved gær-to-hybrid- og coimmunoprecipiteringsanalyser. Vi kortlagde PRMT6-interaktionsmotivet til pUL69 N-terminalen og identificerede kritiske aminosyrer i den argininrige R1-boks med pUL69, som var afgørende for PRMT6 og / eller UAP56-rekruttering. For at teste påvirkningen af formodet methyleringssubstrat på funktionerne af pUL69 konstruerede vi forskellige pUL69-derivater, der indeholdt arginin-til-alanin-substitutioner og testede dem for RNA-eksportaktivitet. Således var vi i stand til at skelne mellem argininer i R1-boksen med pUL69, som var afgørende for UAP56 / PRMT6-interaktion og / eller mRNA-eksportaktivitet. Bemærkelsesværdig, nukleær magnetisk resonans (NMR) analyserer de samme α-spiralformede strukturer for pUL69-sekvenser, der koder for vildtypen R1 / R2-bokse eller et UAP56 / PRMT6-bindingsdefektivt derivat, hvilket således udelukker R / A-aminosyresubstitutioner inden for R1 påvirkede den sekundære struktur af pUL69. Vi konkluderer, at pUL69 N-terminalen er methyleret af PRMT6, og at dette kritisk påvirker funktionerne af pUL69 til effektiv mRNA-eksport og replikation af humant cytomegalovirus. Desuden forsøgte vi at identificere phosphoryleringssteder inden for den funktionelt vigtige N-terminus af pUL69 og karakteriserede in vivo betydning for HCMV-replikation. I silico Analyser forudsagde eksistensen af 13 seriner og 3 threoniner som formodede phosphoryleringssteder inden for de funktionelt vigtige N-terminale 140 aminosyrer af pUL69. MS-baseret phosphosite-kortlægning af immunforurenet FLAG-pUL69 identificerede S18, S51 og T52 som meget sandsynlige phosphorylationssteder i transficerede HEK293T-celler. CoIP-analyser afslørede, at kombinatorisk udveksling af S13 + 15 + 16 + 18 til alanin afskaffede pUL69’s evne til at interagere med UAP56. Vi antager derfor, at cellulære kinaser fosforylerer denne serinstrækning opstrøms for alfa-helix1 og derved bestemmer rekrutteringen af UAP56-rekruttering med pUL69. Ved at sammenligne ekspressionsprofilerne af pUL69-mutanter, der bærer individuelle eller kombinatoriske substitutioner af formodede fosfositter via phos-tag-SDS-PAGE, tilvejebringer vi stærke bevis for, at flere seriner blev phosphoryleret når pUL97 vildtype, men ikke når dets katalytisk inaktive derivat pUL97-K355M udtrykkes samtidig. Da pS46 og pS49 i alfa-helix2 begge går foran en prolin, spekulerede vi i, at de muligvis er substrater for Pin1-medieret peptidyl-prolyl cis-trans-isomerisering og bekræftede en kompleks dannelse af pUL69 og Pin1 ved CoIP-eksperimenter. NMR-eksperimenter til at definere virkningen af fosforylering på strukturen af pUL69 er i gang. I overensstemmelse med vores biokemiske in vitro HB15-afledt virus, der bærer S / T til A-substitutioner inden i pUL69 N-terminalen. Vi har identificeret fosfositter af pUL69, som er nødvendige til henholdsvis UAP56 eller Pin1-rekruttering og bekræftet deres in vivo betydning for HCMV-replikation.

samarbejder

Dr. Dr. Manfred Marschall, Institute of Clinical and Molecular Virology, University of Erlangen-Nuremberg, Germany
Dr. Dr. Armin Ensser, Institute of Clinical and Molecular Virology, University of Erlangen-Nuremberg, Germany
Dr. Dr. Thomas Gramberg, Institut for Klinisk og Molekylær Virologi, Universitetet i Erlangen-Nuremberg, Tyskland
Dr. Dr. Yves Muller, Afdeling for bioteknologi, Biologisk afdeling, Universitetet i Erlangen-Nuremberg, Tyskland
Dr. Dr. Heinrich Sticht, professorat i bioinformatik, Institut for biokemi – Emil-Fischer-Center, Universitetet i Erlangen-Nuremberg, Tyskland
Dr. Dr. Alexander Steinkasserer, Institut for Immunmodulation ved Institut for Dermatologi, University Hospital Erlangen, Tyskland
PD Dr. Christian Heim, Afdeling for hjertekirurgi, Universitetshospital Erlangen, Tyskland
Dr. Dr. Uwe Sonnewald, Afdeling for biokemi, Institut for biologi, Universitetet i Erlangen-Nuremberg, Tyskland
PD Dr. Peter Hemmerich, Leibniz Institut for Aldersforskning – Fritz Lipmann-Institut e.V., Jena, Tyskland
Dr. Dr. Pierre Szepetowski, Institut de Neurobiology de la Mediterranee, Marseille, Frankrig
Dr. Dr. Patrick Hearing, afd. Molekylær genetik og mikrobiologi, Skolen for medicin, Stony Brook University, New York, USA
Dr. Peter Lischka, AiCuris GmbH & Co KG, Wuppertal, Tyskland
Dr. Dr. Jin-Hyun Ahn, Institut for Molekylær Cellebiologi, Sungkyunkwan University School of Medicine, Suwon, Republikken Korea
Dr. Dr. J. Sinclair, Addenbrooke’s Hospital, Cambr >
Finansiering

Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 796, "Omprogrammering af værtsceller af mikrobielle effekter", B3 (indtil december 2017), siden 2018 STA 357 / 7-1
Det tværfaglige center for klinisk forskning Erlangen (IZKF), projekt A71
Wilhelm Sander Foundation nr. 2016.087.1

Saarland universitets medicinsk center – forskning

Forskning Videnskab Fremskridt inden for grundlæggende og klinisk orienteret videnskab er et hovedansvar for det medicinske fakultet på Saarland…
Medierbarndom – forskning

Computeren har længe siden fundet vej ind i klasseværelser og børnerum. Softwareleverandører tilbyder en uhåndterbar række tutorials og…
Theranostics – universitetshospitalet ulm

Theranostic PD Dr. med. V. Prasad Gruppeleder PD Dr. med. V. Prasad Gruppeleder Nuklearmedicin Theranostic Theranostic Group Kræft er en af de førende…
Eksperimentel anæstesiologi – universitetshospitalet ulm

Vores profil Hvad vi gør den Sektion Eksperimentel anæstesiologi af prof. dr. E. Marion Schneider forfølger monocytter og umodne dendritiske celler i…